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[공학]단백질 분리정제

저작시기 2006.01 |등록일 2006.12.27 워드파일MS 워드 (doc) | 11페이지 | 가격 2,000원

소개글

단백질 분리 정제에 대한 실험 프로토콜을 정리한 레포트입니다.
Bradford법, BCA, TBA, LOWRY, TLC 를 정리했습니다.
열심히 한 것인 만큼 많은 도움이 될꺼라고 생각합니다.
참조하셔서 열심히 하세요^^*

목차

단백질 분리정제
Bradford
-purpose
-principle
-materials
-procedure
BCA
-principle
-materials
-procedure
Lowry
-principle
-materials
-procedure
TBA value
-principle
1. TBARs value
-material
-procedure
2. TBA Number
-material
-procedure
TLC
-principle
-material
-procedure

본문내용

▶ Bradford

▪ Purpose
이미 정량 된 특정한 단백질을 이용해 미지의 단백질을 정량 한다.

▪ Principle
단백질에 발색제를 가하여 가시광선 영역의 흡광도를 측정하는 정량법 이다. 산성용액에서 Coomassie Brilliant Blue 염료는 단백질과 결합하게 되고, 이로 인해 염료의 최대 흡광도는 465nm에서 595nm로 이동하게 된다. 595nm에서의 흡광도는 단백질의 농도와 비례하므로 정량이 가능하게 되는데, 이 방법은 발색 반응이 2분 이내에 완결되며 1시간까지 안정성이 유지된다. Bradford방법의 감도는 Lowry방법보다 좋으며, 미량 정량법(microassay)을 사용하면 1~20mg의 단백질량을 측정할 수 있다. Bradford방법은 빠를 뿐 아니라 비단백질 성분들에 의한 방해도 거의 없다. 몇 가지 방해성분이 있으면 결과가 정확하지 않게 되는데, 알려진 방해 성분으로는 TritonX-100과 SDS가있다.

▪ Materials
BSA standard 용액(BAS: Bovin Serum Albumin), Bradford reagent(Protein Dye reagent), 증류수, 시험과, 시험관rack, micro pippet, pittet tip, vortex mixer, UV spectrophotometer, microcentifuge tubes, 미지의 단백질.

**Bradford 시약 만드는 법**
CBB G-250 20mg (0.01%)
Ethanol 10ml (5%)
------------------------------
à잘섞는다.
à 85% phosphoric acid를 20ml 첨가한다.
à dH2O로 final vol.을 200ml 맞춘다.
à filtration or centrifuge한다.

▪ Procedure
① standard 용액을 만든다. BSA 10mg에 100ml의 증류수를 혼합한다. (1mg/ml)
② BSA 1000ul/ml, 500ul/ml, 250ul/ml 용액을 만들어 농도를 달리한다.
③ 각 용액을 시험관에 50ul씩 담는다. 1개의 시험관에 증류수 50ul를 담아 Blank를 만든다. Blank는 스펙의 0값을 인위적으로 지정하기 위해 하는 작업으로 보통은 용질을 용해한 용액을 이용하여 만든다.
④ 각 시험관에 2.5ml Bradford reagent를 첨가하여 단백질을 염색한다.
⑤ Vrtex mixer로 혼합하여 반응을 촉진한다.
⑥ 5분~1시간 내에 A595 에서 비색 측정
⑦ 각 시험관의 OD값을 측정하고, 미지의 단백질의 값 또한 측정하여 기록한다.

주의!!
- Bradford 방법은 다른 단백질 정량법에 비해 민감도가 우수하나 단백질간의 차이가 많기 때문에 정제된 단백질의 절대량을 구하기는 어려운 방법이다. 그러나 단순히 전기영동을 위한 목적이라면 아주 간편하고 우수한 방법이다.
- Bradford reagent를 10배 희석하여 100ml 용액을 사용하면 100ng까지 정량이 가능하다.

참고 자료

여러 참고 자료와 다수의 사이트..
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